RNA와 결합하는‘RNA 결합단백질¹⁾’상에서 정확한 결합 부위를 알 수 있게 됐다. 기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) RNA 연구단 김빛내리 단장(서울대 석좌교수)·김종서 연구위원(서울대 책임연구원)은 사람 세포 속 RNA 결합단백질 상에서 결합을 형성하는 ‘RNA 결합자리²⁾’를 광범위하고 정확하게 찾아낼 수 있는 기법을 개발했다. RNA 결합단백질은 유전자 발현을 조절하는 핵심 인자로, 질병과 세포 기능에 관련된 단백질의 조절 기작을 밝히는 데 기여할 것으로 기대된다.

RNA는 DNA로부터 각 단백질에 해당하는 정보가 전사된 유전체다. RNA는 이 정보를 번역해 단백질을 생산하는데, 전사되고 나서도 번역 효율, 안정성, 세포 내 위치 등 단백질 생산과정이 조절될 수 있다. 이러한 전사 후 조절은 RNA 결합단백질이 RNA에 붙으면서 이뤄진다. 대부분의 단백질은 전사 후 조절을 거치면서 기능을 가지는데, 핵심 인자인 RNA 결합단백질과 RNA 사이 결합 원리와 상호작용은 거의 밝혀지지 않았다. 복잡한 단백질 구조에서 어느 조각이 결합자리인지조차 정확히 알 수 없었기 때문이다.

RNA 결합자리를 보기 위해서는 작은 단백질 조각의 질량을 측정해, 해당 조각을 구성하는 아미노산 및 단백질 내 위치를 추론하는 질량분석³⁾ 방법을 쓴다. RNA 결합단백질-RNA 결합체를 효소로 잘게 쪼개면 단백질 조각인 펩타이드⁴⁾에 RNA 조각이 붙은 형태가 된다. 이 질량 구성을 측정하고 RNA가 붙지 않은 펩타이드와 비교하면, RNA가 붙은 아미노산 자리는 그 질량만큼 차이가 나게 된다.

그러나 기존 연구에서는 RNA가 완전히 분해되지 않고 남아있는 RNA 조각 크기가 제각각이어서 질량 측정에 이 오차를 고려해야 했다. 오차를 고려하고도 확실하게 RNA 조각이 붙었다고 판단되는 아미노산 자리만 알 수 있었다는 것이다. 따라서 1천 개 이상 RNA 결합단백질에서 한 번에 수십~수백 개 RNA 결합자리만 확인 가능했으며, 위치의 정확도도 떨어졌다.

연구진은 기존에 쓰이던 효소 대신 불산을 이용해 문제를 해결했다. 불산은 RNA를 동일한 분자 한 개로 완전히 분해해, 한 번에 2,000개 RNA 결합자리를 찾아낼 수 있었다. 불산 처리 후 RNA 조각의 질량을 쟀더니 동일한 유리딘⁵⁾ 분자만 남음을 확인했다. RNA 조각의 질량 오차를 줄임으로써 RNA 결합자리를 더 많이 알아낼 수 있었던 것이다. 결과적으로 세포 전체 RNA에 결합한 600 개의 RNA 결합단백질 내에서 약 2,000 종류 RNA 결합자리를 아미노산 수준의 고해상도로 찾아낼 수 있었다.

이렇게 찾은 RNA 결합자리를 바탕으로 연구진은 새로운 가설들을 제시했다. 먼저 질병 및 세포 기능에 중요한 단백질에서 RNA 결합자리를 다수 발견했다. 일례로 근위축성 측삭 경화증의 원인 단백질인 TDP-43, DNA 복구에 필수적인 PRKDC에 존재하는 RNA 결합자리를 찾았다. 이는 기존에 알려지지 않았던 RNA와의 결합이 각각 단백질의 기능을 조절할 수 있음을 시사한다. 또 RNA 결합자리가 단백질의 공유결합 변형 자리와 비슷함도 보였다. RNA 결합자리의 결합력 조절 원리가 공유결합 변형일 수 있다는 뜻이다.

이번에 규명한 RNA 결합자리를 토대로 세포 내 RNA-RNA 결합단백질 상호작용을 세밀하게 연구할 수 있을 것으로 보인다. 또한 이번 기술을 변형해 RNA 뿐만 아니라 DNA와 결합하는 단백질로도 확장할 수 있으리라 기대된다.

이번 연구성과는 Nature Structural & Molecular Biology(IF 12.109)에 6월 9일 0시(한국시간) 온라인 게재됐다.

그림설명

▲ 그림 1. 새로 개발한 RBS-ID 실험 기법 모식도.먼저 UV를 이용해 RNA-RNA 결합단백질 간 공유결합을 형성한다(1). 트립신 효소로 단백질을 분해한 후, RNA-펩타이드 결합체를 추출한다(2). 이후 불산을 이용해 RNA를 완전히 분해한다(3). 이후 분석 과정에서, 펩타이드에 결합한 다양한 RNA 조각들이 불산으로 동일한 분자만 남게 되어, 검출 한계를 넘어서는 RNA-펩타이드 결합체가 많아진다. 또 RNA 조각이 이미 최소화 되었기 때문에 펩타이드를 한 번 더 쪼갤 때(MS2) 더 분해되지 않아, 이를 통해 RNA 결합 위치를 정확히 특정할 수 있다(4). 또, RNA 분자를 한 가지만 고려한 데이터베이스를 사용해, 펩타이드 동정 효율이 증가하게 된다(5). 결과적으로 RBS-ID는 RNA 결합자리를 고해상도·광범위하게 동정할 수 있다.

▲ 그림 2. RBS-ID의 광범위한 동정 범위 및 기존 기법들과의 비교.RNP^xl과 CAPRI등으로 대표되는 기존의 RNA 결합자리 동정 기법들은 수십-100여 개의 단백질로부터 수십-수백 개의 RNA 결합자리를 동정하는 데 그쳤다. 이에 반해 RBS-ID는 동정 범위를 압도적으로 증가시켜, 세포 내 전체 RNA 및 전령 RNA에 결합하는 약 600 개의 단백질에서 약 2,000 개의 RNA 결합자리를 동정했다.

▲ 그림 3. spCas9의 RNA 결합자리 동정 및 유전자 편집 기능에 중요한 RNA 결합자리 규명.이번 연구에서 개발한 기법을 이용, 후속 실험으로 spCas9-sgRNA 결합체에서 84개의 RNA 결합자리를 동정했다. RNA는 결합체 구조에서 spCas9과 sgRNA가 결합하는 표면을 따라 존재한다. 이 중 두 RNA 결합자리(Y450, R919)는 spCas9의 유전자 편집 기능에 중요해, 이 자리들에 돌연변이가 일어나면 spCas9에 의한 유전자 편집 빈도가 감소하는 것으로 드러났다.

▲ 그림 4. 연구진 사진.왼쪽부터 김빛내리 RNA 연구단장(공동교신저자), 배종우 연구원(제1저자), 김종서 책임연구원(공동교신저자). 인물 뒷쪽 기기는 본 프로젝트에 사용한 질량분석기이다(Orbitrap Fusion Lumos, Thermo Fisher Scientific).