기초과학연구원(IBS, 원장 노도영) RNA 연구단 김종서 연구위원(서울대 조교수)·김빛내리 단장(서울대 석좌교수)은 세포 내 단백질에서 RNA와 결합을 형성하는 ‘RNA 결합자리¹⁾’를 염기 종류에 따라 정확하게 찾아내는 기법을 개발했다. 생명현상 조절에 필수적인 RNA-단백질 상호작용의 원리 규명에 크게 기여할 것으로 기대된다.

RNA 결합자리의 동정은 세포 기능 조절을 규명하기 위한 핵심 단계라고 할 수 있다. RNA에 단백질이 결합하여 번역 효율, 안정성, 세포 내 위치 등 단백질 생산과정을 조절해 정상적인 유전자를 발현시키기 때문이다. 이때 RNA 결합자리를 확인하려면 작은 단백질 조각의 질량을 측정해, 해당 조각의 아미노산 및 단백질 내 위치를 추론하는 ‘질량분석²⁾’ 방법이 필요하다.

연구진은 지난해 짧은 파장의 자외선(UVC)³⁾과 불산을 적용, RNA 내 유라실⁴⁾과 단백질의 교차결합을 형성하여 RNA 결합자리를 찾는 기술을 개발했다. 그런데 이 기술로는 RNA-단백질 상호작용의 복합적 파악이 어려웠다. RNA-단백질 교차결합 형성 효율이 매우 낮으며, 가능한 RNA 염기 종류도 유라실 하나뿐이었기 때문이다.

연구진은 긴 파장의 자외선(UVA)⁵⁾과 광활성 RNA⁶⁾ 표지법을 활용해 작년 연구의 한계를 극복했다. 우선 세포 내 RNA를 4-티오유리딘과 6-티오구아노신⁷⁾ 두 종류의 광활성 염기로 표지했다. 이후 UVA를 이용해 결합된 단백질과 특이적 교차결합을 유도하고, 단백질에 결합된 긴 RNA를 불산 처리하여 화학적으로 가수 분해했다. 그리고 질량분석 방법으로 남은 RNA 조각의 분자량을 확인했다. 이 정보를 토대로 4-티오유리딘과 6-티오구아노신의 각 염기 종류에 해당하는 특이적 RNA 결합자리를 고효율로 동정해냈다. 또한, 데이터 분석 프로그램을 발전시켜 RNA 결합자리를 포함하는 펩타이드를 정확히 정량했다.

이로써 연구진은 염기 종류 및 교차결합 방식에 따른 RNA-단백질 상호작용 양상의 차이를 면밀히 규명했다. 이는 새로 발견한 광활성 RNA 결합자리 뿐 아니라, 기존 UVC를 이용한 RNA 결합자리까지 망라하는 성과다. 나아가 RNA-단백질 복합체 구조 데이터를 접목해, 질량분석으로 규명한 RNA 결합자리가 밝혀진 단백질-RNA 구조와 일치하는 염기 종류와 상호작용함을 확인했다. 또 단백질의 구조가 불안정하여 기존 데이터로 파악할 수 없었던 RNA-단백질 상호작용도 RNA 결합자리를 통해 밝혀냈다.

이번에 개발한 질량분석 기법과 새로 동정한 3,000개 이상의 RNA 결합자리 정보는 RNA-단백질 상호작용에 의한 생명현상 조절 이해에 활용될 수 있어 가치가 크다. 특히 광활성 RNA의 대사표지와 최근 획기적으로 개선된 단백질 구조 예측 프로그램⁸⁾들을 접목하면, RNA-단백질 상호작용의 동적 변화와 분자적 기전을 세밀히 이해할 수 있으리라 기대된다.

이번 연구성과는 Nature Communucations(IF 14.92)에 10월 15일 온라인 게재됐다.

▲ [그림1] 광활성 RNA를 이용한 pRBS-ID 연구 결과 모식도.pRBS-ID를 위해서는 먼저 UVA를 이용해 광활성 RNA-단백질 간 공유결합을 형성한다. 그 뒤 단백질은 펩타이드로 만들고, RNA는 불산을 이용해 화학적으로 분해한다. 이후 질량분석을 수행하면 펩타이드에 교차결합한 광활성 RNA 조각의 질량으로부터 RNA 결합자리를 개별 아미노산 수준의 고해상도로 동정할 수 있다. 연구진은 pRBS-ID를 활용한 본 연구에서 RNA 결합자리의 염기 종류별 특성을 파악했고, RNA 결합자리를 정량값을 정확히 측정했으며, RNA-단백질 복합체의 구조 데이터에 기반한 RNA-단백질 상호작용 분석의 기반을 마련했다.

UVC RNA 결합자리 빈도 4SU RNA 결합자리 빈도 6SG RNA 결합자리 빈도 4SU RNA 결합자리 빈도
▲ [그림 2] 교차결합 방식 및 염기 종류에 따른 RNA 결합자리의 아미노산 빈도 비교.(왼쪽) UVC에 의해 형성된 RNA 결합자리와, UVA 및 4-티오유리딘(4SU)에 의해 형성된 RNA 결합자리의 아미노산 빈도 비교. UVC의 경우 메티오닌(M)의 빈도가, 4SU의 경우 히스티딘(H)의 빈도가 특이적으로 높다. (오른쪽) UVA 및 4-티오유리딘(4SU) 혹은 6-티오구아노신(6SG)에 의해 형성된 RNA 결합자리의 아미노산 빈도 비교. 4SU의 경우 히스티딘(H)과 페닐알라닌(F)의 빈도가, 6SG의 경우 트립토판(W), 시스테인(C), 타이로신(Y)의 빈도가 특이적으로 높다.

FAU 4SU RNA 결합자리 (n=5) 상대적 존재량 아미노산 위치 PDB: 4V6X EDF1 6SG RNA 결합자리 (n=1) 상대적 존재량 아미노산 위치 PDB: 6ZVH 18S rRNA U607 F49 18S rRNA G534 W44 G552 G535
▲ [그림 3] pRBS-ID를 이용한 구조가 불안정한 단백질 부위의 RNA 결합자리 동정.pRBS-ID 기법을 사용해 불안정성으로 인해 기존의 구조 데이터에서는 확인하기 어려웠던 RNA 결합자리를 새로 동정했다. 위쪽에는 단백질 서열상 RNA 결합자리의 위치 및 상대적 정량값이, 아래쪽에는 기존의 RNA-단백질 복합체 구조에서 RNA 결합자리 및 상호작용 가능성이 높은 RNA 염기가 표시되어 있다. (왼쪽) 리보솜의 주요 구성 단백질인 FAU의 49번 페닐알라닌(F49)와 18S rRNA의 607번 유라실(U607)이 결합 가능하다. (오른쪽) 리보솜 조절에 중요한 단백질인 EDF1의 주요 구성 단백질인 FAU의 44번 트립토판(W44)와 18S rRNA의 534/535/552번 구아닌(G534/535/552)들이 결합 가능하다.

▲ [그림 4] 연구진 사진.왼쪽부터 김빛내리 RNA 연구단장(공동교신저자), 배종우 연구원(제1저자), 김종서 연구위원(공동교신저자). 인물 뒷쪽 기기는 본 프로젝트에 사용한 질량분석기이다 (Orbitrap Fusion Lumos, Thermo Fisher Scientific).

1) RNA 결합자리 (RNA-binding site): RNA 결합단백질에서 RNA를 직접 인지하여 결합하는 아미노산 자리.

2) 질량분석 (Mass spectrometry): 전체 분자 및 이를 쪼갠 분자 질량을 각각 측정해 분자의 구성을 밝히는 기술.

3) UVC: RNA-단백질 교차결합을 형성할 수 있는 짧은 파장(254 nm)의 자외선.

4) 유라실 (Uracil): RNA를 이루는 네 가지 염기(아데닌, 구아닌, 사이토신, 유라실) 중 하나.

5) UVA: 광활성 RNA-단백질 교차결합을 형성할 수 있는 비교적 긴 파장(365 nm)의 자외선.

6) 광활성 RNA (Photoactivatable ribonucleosides): 염기 내 산소 원자 하나가 황 원자로 치환되어, 특정 파장의 자외선에 의해 활성화되어 단백질과 교차결합을 형성하는 RNA. 4-티오유리딘과 6-티오구아노신이 있다.

7) 4-티오유리딘, 6-티오구아노신: 광활성 RNA의 종류로, 각각 유리딘 및 구아노신과 대응됨.

8) 2021년 7월 발표된 AlphaFold(Google Deepmind)와 RoseTTAFold(David Baker lab)가 있다.